الف- در حال حاضر آزمایش های تشخیص مولکولی، استاندارد طلایی (Standard Gold ) تشخیص بیماری-SARS 2-CoVاست که با حساسیت و دقت بسیار بالا در فاز حاد بیماری قابلیت تشخیص بیماری را دارا می باشد. مقدار RNA ویروس با استفاده از این روش قابل تعیین بوده و فقط در مواردی که حداقل 14 روز از بیماری می گذرد، ممکن است به خاطر تعداد کم RNA ویروس قابل تشخیص نباشد و بیشتر کاربرد آن همانطور که گفته شد در مراحل اولیه و حاد بیماری است. تائید قطعی ابتال به 2-CoV-SARS براساس کشف توالی اختصاصی اسید نوکلئیک ویروس بوسیله روش PCR-qRT reaction chain polymerase Transcriptase Reverse ، (ودر صورت لزوم، تائید آن از طریق تعیین توالی (sequencing acid nucleic است .تاکنون نواحی مشخصی در ژنهای E ، N ، S ، ab 1ORF RdRp و ORF-a1 به عنوان هدف مورد استفاده قرار گفته اند .
در بیشتر افراد عالمت دار مبتال به عفونت 2-CoV-SARS ، RNA ویروسی در سواب نازوفارنکس با اندازه گیری آستانه چرخه ( Ct ) از روز اول عالئم تشخیص داده شده و در هفته اول شروع عالئم به پیک می رسد. Ct تعداد چرخه های تکرار مورد نیاز برای توالی یک سیگنال فلورسنت است، مقادیر کمتر Ct نشاندهنده بارهای باالتر RNA ویروسی است. مقدار Ct کمتر از 41 از نظر بالینی PCR مثبت قلمداد می شود. این نتیجه مثبت در هفته 3 شروع به کاهش کرده و متعقبا غیر قابل شناساسی می شود. با این حال، مقادیر Ct بدست آمده از بیماران بستری بد حال پایینتر از موارد Ct در موارد خفیف تر بیماری است. مثبت بودن PCR در این بیماران ممکن است بیش از 3 هفته پس از شروع بیماری ادامه یابد، در حالی که مبتالیان به شکل خفیف تر بیماری در این مدت PCR منفی خواهند شد. مطابق با توصیه سازمان جهانی بهداشت، برای تشخیص 2-CoV-SARS در مناطقی که این ویروس در چرخش نیست،یک نتیجه مثبت آزمایش تشخیص مولکولی برای حداقل دو هدف متفاوت در ژنوم ویروس، که حداقل یکی از آنها برای این ویروس اختصاصی باشد و یا نتیجه مثبت آزمایش تشخیص مولکولی برای یک توالی هدف مشترک بین بتاکرونا ویروسها و ویروس 1-CoV-SARS که با آزمایش تعیین توالی(sequencing )به تائید برسد کافیست .اما در مناطقی که ویروس بطور وسیع در حال چرخش است میتوان از الگوریتم ساده تری که در آن غربالگری برای جستجوی فقط یک توالی هدف برای تشخیص انجام میشود، استفاده نمود. بدست آوردن یک نتیجه منفی وجود بیماری را رد نمی کند و در بیمارانی که ظن قوی نسبت به ابتال وجود داشته باشد، خصوصا موقعی که فقط از نمونه های دستگاه تنفسی فوقانی برای انجام آزمایش استفاده شده باشد، باید نمونه برداری تکرار ودر صورت امکان از نمونه های دستگاه تنفسی تحتانی برای انجام آزمایش استفاده شود. نمونه دستگاه تنفسی فوقانی( سواب نازفارنکس و سواب اورو فارنکس، هر دو )که با استفاده از سواب استریل نازک داکرون با دسته پالستیکی یا آلومینیومی گرفته میشود، نمونه اصلی مورد نیاز برای آزمایش است .نمونه باید توسط پزشک، پرستار، کارشناس آزمایشگاه و سایر کارکنان که برای این کار آموزش دیده و تجربه کافی داشته باشند، گرفته شود .برای نمونه برداری باید از سواب مخصوص نمونه گیری از ناحیه نازوفارنکس و اوروفارنکس مورد استفاده قرار گیرد( سواب پنبه ای برای این کار مناسب نیست و سواب با دسته چوبی به هیج عنوان نباید مورد استفاده قرار گیرد .)پس از گرفتن نمونه، سواب نازفارنکس و سواب اورو فارنکس، هر دو در یک لوله مقاوم، در پیچ دار و غیرقابل نشت که حاوی محیط انتقال ویروس )Transport Viral )باشد قرار گرفته و درب آن بصورت کامل بسته میشود .هر لوله مربوط به یک بیمار است و باید شناسه های الزم، محل و تاریخ نمونه گیری بطور خوانا بر روی برچسب آن نوشته شود .نمونه باید در همان روز، با رعایت شرایط استاندارد بسته بندی و انتقال امن و ایمن نمونه، در شرایط دمایی خنک ( 8-2درجه سانتی گراد( به آزمایشگاه حمل شوند .پایداری نمونه در
شرایط یخچال کمتر از 4 روز است .در غیراینصورت نمونه ها باید تا زمان آزمایش در شرایط دمایی حداقل منفی 21 درجه سانتیگراد ( در حالت ایده آل منفی 71 درجه سانتی گراد ) حفظ شوند. سایر نمونه مثل خلط و BAL هم ممکن است برای آزمایش گرفته و در داخل یک ظرف یا لوله مقاوم، در پیچ دار و غیرقابل نشت ارسال شوند .این نمونه های نیاز به محیط انتقال ندارند. به طور کلی، عوامل زیر در حساسیت آزمایش تشخیص مولکولی و اعتبار نتایج آن مهمترین تاثیر را دارند: – محل آناتومیک نمونه برداری و نحوه جمع آوری نمونه ( مهارت نمونه گیر) – زمان و مرحله بیماری (انتظار این است که افراد مبتال که دارای عالیم بالینی هستند ویروس بیشتری نسبت به قبل و بعد از آن داشته باشند) – رعایت استانداردهای تضمین کیفیت آزمایشگاهی در نگهداری و ارسال نمونه و انجام آزمایش – نوع کیت تشخیص مولکولی یا پروتکل آزمایشگاهی که برای تشخیص مورد استفاده قرار می گیرد. – دفعات انجام آزمایش (در شرایطی که نتیجه یک آزمایش منفی میشود، تکرار آزمایش میتواند به یافتن موارد مثبت کمک کند) همانطور که گفته شد روش PCR رایج ترین و قابل اعتمادترین آزمایش برای تشخیص 2-CoV-SARS است. با این وجود ، باید به این نکته توجه داشت که نمونه، حاوی RNA ویروسی است و بیانگر ویروس زنده فعال در نمونه نبوده و برای تایید این موضوع، بایستی کشت ویروسی انجام داد. با افزایش سطح آنتی بادی ها ی خنثی کننده ویروس، بیماران به آرامی بهبود یافته و در بیشتر موارد تا هفته سوم، ویروس های فعال در بدن کاهش یافته و در نهایت حذف می شوند. – مواردیکه در تفسیر نتایج PCR حائز اهمیت می باشند: بطور کلی چهار دلیل اصلی که موجب مثبت شدن مجدد آزمایش PCR در نمونه بیماران بهبود یافته 2-CoV-SARS می گردد عبارتند است از:
1 .خطای آزمایش نتایج منفی کاذب در ازمایش PCR غیر معمول نیست. دالئل مختلفی موجب بروز نتایج منفی کاذب می شود که عبارتند است از: – جمع آوری نامناسب نمونه – ذخیره سازی نامناسب و حمل نمونه – نقص در مواد شیمیایی و روش های مورد استفاده در PCR
بدون دیدگاه